液相色谱仪分析肉食品中常见4种抗生素残留

 大环内酯类与氯霉素类药物是两类应用广泛的广普抗生素，由于这两类抗生素能够有效预防和治疗家畜传染病和寄生虫病的发生，有些还具有促进动物生长发育的功用。因此，为了降低养殖成本，提高经济效益，在家畜养殖中广为使用。但是，近年来由于在禽畜养殖过程中过量使用抗生素又不遵守休药期的规定，在牛羊肉、猪肉以及鸡鸭鱼肉中检测出了各种抗生素。这种残留可以通过食物链进入人体，进而对人体造成各种危害。红霉素、泰乐菌素等大环内酯类可致肝损害和听觉障碍。更严重的是长期大量滥用广谱抗生素会导致肠道微生物菌群被抑制，使人体产生抗药性，这种抗药性导致人类感染疾病之后治疗难度加大，治疗成本升高。　　为了保障人类的生命健康，世界各国卫生组织以及食品药品监督管理部门都已经将肉食品中各种抗生素残留量作了严格规定，并且以抗生素在肉食品中的残留量作为产品进口的贸易壁垒，如美国和欧盟对阿维菌素在肉食品中的最高残留限量为25ug/kg，泰勒菌素为100ug/kg，替米考星为100ug/kg，伊维菌素为40ug/kg。目前肉食品中大环内酯类抗生素常用液一质联用进行全面分析。氯霉素类药物常用气相色谱及液相色谱分析。而用高效液相色谱法同时分析肉食品中两类常见抗生素还未见文献报道。

   一、LC2100高压恒流泵：2台
      uv2100紫外检测器：1台 N2000色谱工作站：1台7725i手动进样阀：1套

   色谱工作站：1套 

   二、LC2100高效液相色谱仪特点

★采用世界上最优秀的光学检测系统（安捷伦液相色谱检测系统），交差光路设计

★输液泵单向阀来源自世界最优秀的输液泵技术

★  传承了美国瓦里安技术，确保了泵的可靠性及稳定性

★  检测器采用了安捷伦科技技术

★  在国内同行业率先真正不需换灯，实现全波长可变检测分析

★  智能化高，可实现网络化平台监控，提高了你的QC效益。

★  自动化，让你从繁锁的分析操作中解放出更多的时间！

技术特点

★ 输液泵单向阀来源自瑞士进口、密封圈来自美国原装进口、氘灯以及氘灯电源来自德国原装进口、管路和各种接头来源自美国原装进口

★ 泵形式：串联双柱塞 浮动式密封圈；泵头自冲洗功能，泵无须手动排空即可输液

“自吸式单向阀”技术，可延长密封圈使用寿命；

★ 程序化的溶剂类和压缩因子，可自动补偿；完整的预清洗功能，更于快速溶剂更换

★ 三条流量校正曲线以及特有的多点参数校正，保障了极高的流量准确性； 

★ 梯度：高压2-3元；梯度方式：高压，梯度洗脱内部软件可自控制，可通过PC机及泵控制

★ 紫外检测器具有自动波长定位调整，自动调零，多量程输出选择

★  D2灯（德国原装）：寿命3500小时，保证使用2000小时

  三、高压恒流输液泵技术参数：

四、紫外可见检测器技术参数

三、实验

　　1 仪器与试剂

　京科瑞达　 LC-2100高压恒流泵

　　uv2100紫外检测器

　　超声波清洗仪　　　　　　　　　　　　　

　　反相色谱柱C18　　

　　固相萃取柱　　　　　　　　　　　　　　　

　　泰乐菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考标准品均为天津市科密欧化学试剂开发中心监制　

　　乙腈、正己烷均为优级纯　

　　其它试剂均为分析纯　

　　实验用水均为二次蒸馏水　

　　新鲜牛肉与鸡肉均为超市所购

　　2 色谱条件　　　　　　　　　　　

　　C18反相色谱柱　

　　柱温25℃，流速1mL/min，进样量25uL，梯度洗脱条件A相为甲醇，B相为0.2mol/L磷酸二氢钠含10%(体积比)甲醇，调节pH为3.0，梯度洗脱程序：0-2min10%A，2-8min 10%-40%A，8-9min40%-10%A，检测波长入为275nm

　　3 标准溶液的配制及标准曲线的制备

　　分别准确称取各标准品0.01g（精确至0.001g），用甲醇分别溶解并定容至100mL，配制成100mg/L标准储备液，于一4℃冰箱中冷藏，测定时将各标准溶液混合后稀释成0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0mg/L的溶液。分别以泰乐菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数（r）。

　　4 样品处理

　　将新鲜牛肉及鸡肉分别匀浆后，于-18℃冰箱中保存。测定时，将匀浆冷冻保存的牛肉与鸡肉样品于室温下自然解冻。分别准确称取20.0g样品置于50mL具塞锥形瓶中，加入20mL乙腈，超声10min，转移至离心管，以5000r/min离心10min，收集上清液，离心沉淀物用上述方法重复提取2次，合并上清液。向得到的清夜中加入30mL正己烷，用力振荡5min，静置分层，弃去上层正己烷层。然后将溶液于40℃减压旋转蒸发至约2mL，氮气吹干后加入5mL甲醇一磷酸盐混合液超声溶解抗生素，最好定容至10mL。　　　

　　5样品净化

　　将HLB固相萃取小柱用5mL甲醇、5mL去离子水活化后，将4得到的样品处理液上固相萃取柱(柱流速保持1滴/s），用10mL蒸馏水、10mL5%甲醇水溶液淋洗固相萃取柱，再用10mL甲醇洗脱，将洗脱液用氮气吹干后，加入流动相超声定容至5mL，最后，经0.22um滤膜过滤后进样。　　　　

　　6方法的准确度、精密度、线性范围、回收率

对于牛肉样品分别添加0.1、0.5、1.0mg/kg 3个水平的混合标准溶液，按照4与5样品处理及净化方法，每个水平平行测定4次，进行回收率实验，并且以3倍信噪比分别计算泰乐菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考在牛肉样品中的检出限，在测定条件下4种药物在0.1—20mg/L范围内均呈线性，线性方程与相关系数、平均回收率、相对标准偏差见表 　

7、实际样品检测

本实验分别对10份牛肉样品和10份鸡肉样品中泰乐菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考进行检测，没有发现牛肉样品中含有以上抗生素，但是在4份鸡肉样品中都不同程度检测到了泰乐菌素，最高为200ug/kg，最低为80ug/kg，平均含量为120ug/kg，高于我国动物性食品中兽药最高残留限量标准（100ug/kg）

   我国动物性食品中兽药最高残留限量标准规定泰乐菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考在肉品中的最高残留量（MRL）分别为100、75、1.5、200ug/kg，本实验所测泰乐菌素、替米考星、氟苯尼考的检出限分别为20、32、16ug/kg均在最高残留限量以下，符合残留检测分析要求。由于氯霉素药物特殊性，欧盟对氯霉素的检出限要求为0.1ug/kg，美国FDA对氯霉素的检出限要求为0.3ug/kg，按照本实验方法，氯霉素检出限为19ug/kg，还未达到国际上的要求，这是因为提取方法和所用检测器所致。今后应该发展更加灵敏的方法以提高氯霉　素。本实验方法的平均回收率较高（75%-87%），而且步骤简单、操作容易、重现性较好　相对标准偏差为1.35%-5.41%，表明方法稳定可靠。